【技术干货】PCR实验中常见问题及解决方案

聚合酶链式反应（pcr）是一种用于放大扩增特定的dna 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点是能将微量的dna 大幅增加。我们进行核酸扩增时，经常会不定的出现一些异常问题，那么遇到这些问题该怎么解决呢？接下来跟着远慕一起来看看前辈们的经验。没有ct值检测结果遇到没有ct 值情况,排查是否有以下问题: 1.循环数不够(一般不超过45 循环，不仅背景值提高,定量也不准); 2.pcr 程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般sg 法采用72 ℃延伸时采集，taqman 法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中。3.引物或探针降解。可通过page 电泳检测引物和探针是否降解; 4.模板量可能降解或上样量不足(不超过5 ng，根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解，应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样本小量分装储备，避免反复冻融; 5.引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子，以确保扩增基因组dna；上下游引物tm 值超过4 ℃以上也会影响扩增)。ct值过晚在相对定量中, ct 值一般控制在15 ~ 25 之间比较好，如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品，ct 值会增大, 但是一般不宜超过4 循环, 否则定量不准确。. 因此，判断ct 值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。1.扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化；引物或探针设计不合理，需要重新设计；2.pcr 程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长1s)；3.mgcl2 浓度不合适，增加镁离子浓度等。pcr 各种反应成分的降解或加样量的不足；4.pcr 产物太长。pcr 产物设计超过5 bp；5.模板中存在抑制物。用高纯度模板进行pcr 检测或将模板进行稀释。阴性对照扩增有信号阴性对照扩增有信号排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染:1.引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。2.引物浓度不佳。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。3.镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix 试剂盒。4.模板有基因组的污染。rna 提取过程中避免基因组dna 的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。5.交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染, 或操作环境中有气溶胶造成污染, 建议对操作环境进行处理, 或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。标准曲线不佳标准曲线线性关系不佳r2 < .9，很有可能是以下环节存在问题:1.标准品稀释或者加样误差,使得标准品不呈梯度。2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,将高浓度dna 模板分装,保存于-2 ℃或-8 ℃，现配现用。3.引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针。4.模板中存在抑制物。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量以5 ~ 5 ng 为宜。熔解曲线峰不特异熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题:1.引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现；引物浓度不佳, 尤其是涉及二聚体存在时, 适当降低引物浓度, 并注意上下游引物的浓度比例; 2.模板有基因组污染。rna 提取过程中避免基因组dna 的引入, 或通过引物设计避免非特异性扩增。3.离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度, 或选择更适合的mix 试剂盒, 不同试剂盒在该方面的优化能力不适合, 有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果。扩增曲线异常遇到扩增曲线异常，比如s 型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题：1.模板的浓度太高或者降解。2.荧光染料的降解。3.人为污染。在操作荧光定量pcr 时，带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等。4.液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里; 5.气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。扩增效率低该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:1.反应试剂中部分成分比例是否最佳，另外考虑荧光染料是否降解。2.反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间。3.反应体系中有pcr 反应抑制物。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释，再加入反应体系，减少抑制物的影响。其他原因模板反复冻融、模板长时间在紫外光下照射导致的模板发生突变；基因序列与ncbi 上的不一致。今天的讲解就到这里啦，关于pcr的这些小陷阱你了解了吗？如果有其他实验相关的问题也可以咨询我们远慕生物技术人员哦~

扬州到福清直达货运专线_扬州到福清物流货运专线
电加热蒸汽锅炉的原理和构造
武汉江岸区到宽城直达物流专线_武汉江岸区到承德宽城物流公司
转让石墨污水处理二手卧螺离心机
佛山到南京栖霞区直达物流专线_佛山到栖霞区物流公司
【技术干货】PCR实验中常见问题及解决方案
ZRX-30656振筛机日常保养以及检查与存放
AO二级生化污水处理装置
兴化到永修县货运专线「返程车」_兴化到九江永修县物流公司
管内式强磁水处理仪磁化过滤器的主要原理
宁波镇海区到苏州货运专线回程车_宁波镇海区到苏州物流公司
<咨询>扬中矿山布袋除尘器哪家好？厂家耀先工业布袋除尘器全年*
环境应力筛选在环境试验箱的应用
安装摇摆筛需要注意些什么
华克斯提供橡塑保温板具有的优势介绍
玉米加工设备正常稳定运行的自动化程度高
RTJ-SQ燃气调压器RTJ-S产品特性和结构及安装
昆山到方正县货运专线_优质昆山到哈尔滨方正县物流专线公司
上海奉贤区到迭部县直达货运专线_上海奉贤区到甘南迭部县物流货运专线
佛山龙江镇到成都龙泉驿区直达货运专线_佛山龙江镇到龙泉驿区物流货运专线