Western blot的实验技巧
western blot的实验技巧
western blot实验看似简单，但流程又很繁琐。很多同学往往做了很长时间的实验之后，却得不到理想的实验结果，甚是苦恼。其实，western blot实验是有很多注意点和实验技巧的，小编今天给大家整理了一些非常关键的实验事项：
蛋白提取
蛋白提取是实验的第一步，也是最重要的一步，很多实验结果不好往往是由于蛋白提取出现了问题（但是很多同学却忽视了蛋白提取质量对实验结果的重要性）。以下几个因素是经常导致wb结果不理想的原因：
★蛋白提取的裂解液中，目的蛋白含量太低
一些蛋白在组织中的蛋白含量很低（例如转录因子等核蛋白，gpcr、cd分子等膜蛋白），如果提取蛋白的时候没有做到富集，往往后续wb显色的时候会导致背景很脏，甚至导致白板的出现。这时候需要专门的蛋白富集提取方法来提取蛋白，例如相对于全细胞或全组织裂解物来说，核表达蛋白在细胞核裂解物总蛋白中占有相当大的比例，这样凝胶条带中可以载入更多的目的蛋白。另一个优点是排除了杂质成分潜在的交叉反应。浓缩使信号大化（例如检测核蛋白要用核裂解物）。
如上图结果所示，使用特定的蛋白提取试剂盒提取蛋白，可以有效的富集特定细胞组分，保证目的蛋白的上样量。
注：实验中使用gapdh(m20006)分析细胞浆蛋白提取物，使用atpase(t40109)分析细胞膜蛋白提取物，使用histone(p30266)分析细胞核蛋白提取物。
膜蛋白产品提取试剂盒货号：a10008，核蛋白产品提取试剂盒货号：a10009
★ 蛋白提取后出现降解
在蛋白质的提取过程中，蛋白酶在细胞或组织裂解后释放，降解蛋白质样品，从而降低蛋白质样品的量。这样往往导致后续实验中检测不到目的蛋白或蛋白降解带明显出现。为防止蛋白质被蛋白酶所降解，要加入特异性的蛋白酶抑制剂来抑制蛋白酶活性。很多同学在实验过程中也加入了蛋白酶抑制剂，但是为什么还会出现蛋白降解呢？主要原因是很多同学往往只加入了一种蛋白酶的抑制剂，但是蛋白酶是有非常多种类的，每一种蛋白酶均需要一种特定的蛋白酶抑制剂来抑制其蛋白酶活性。所以为了防止蛋白降解，需要加入各种蛋白酶抑制剂。
方便的做法是购买现成的cocktail形式的蛋白酶抑制剂，这种蛋白酶抑制剂是将常用的数种蛋白酶抑制剂混合到一起，制备成了即用型的试剂产品，用起来很是方便。
abmart提供了一款cocktail形式的蛋白酶抑制剂，可以有效地防止蛋白提取过程中的蛋白降解问题。a10004，200x蛋白酶抑制剂复合物（200x protease inhibitorcocktail）【同sigma p1860】。
电泳转膜
对于较大分子量的蛋白（大于100 kda），电泳转膜这个步骤是很容易出现问题的，主要是包括以下几个方面：
1. 对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心。
2. 大蛋白易在凝胶里形成沉淀，从而影响转膜。转膜时在电转移缓冲液加入sds至终浓度0.1%，避免出现这种情况。甲醇易使sds从蛋白上脱失，因此相应降低甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3. 降低电转移缓冲液中甲醇的比例，这样可以促进凝胶的膨胀，更易于大蛋白的转出。
4. 只有使用硝酸纤维素膜时，甲醇才是必需的。如果是pvdf膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前pvdf需用甲醇活化。
5. 选择湿式，4℃ 转膜过夜，以取代半干式转膜。
这里，同学们需要注意：很多同学习惯使用预染marker判断转膜是否成功。该方法很是便捷，但是却无法判断每个泳道的转膜情况和是否有气泡污染。所以最好方法是使用“丽春红染色qc转膜质量”。
为检测转膜是否成功，用tbst洗膜，然后用丽春红染色，室温下震荡5分钟。然后将膜浸泡在水中直至水变清且出现蛋白条带。观察膜上的条带是否清晰，各分子量条带均可见，无明显白色空斑（气泡导致）。
用tbst或水重复洗膜直至膜*脱色，pvdf膜需用甲醇活化后再用tbst洗，然后进行后续实验操作。
10*丽春红贮备液：2%丽春红s溶于30%三氯和30%磺基水杨酸，震摇混匀。（或者购买现成的10*丽春红贮备液，货号: a10010）
一抗孵育/二抗孵育
★一抗稀释液
为防止实验结果的背景比较脏，最好使用封闭液来稀释一抗，这样可以避免一抗可能与封闭液有交叉反应。
★使用错二抗
有些抗体是小鼠抗体，有些抗体是兔子抗体，均需要使用对应的二抗来显色，用错了就会导致白板。特别是很多时候希望一抗和内参抗体同时孵育，使得目的蛋白检测和内参调平一步到位。但是很多时候是一抗是兔多抗，内参是小鼠单抗，一旦大意疏忽，就会导致实验出错。
abmart推出了一款“防错二抗”（鼠兔通用二抗），一管抗体解决所有问题，让实验变得很轻松。
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蛋白提取
蛋白提取是实验的第一步，也是最重要的一步，很多实验结果不好往往是由于蛋白提取出现了问题（但是很多同学却忽视了蛋白提取质量对实验结果的重要性）。以下几个因素是经常导致wb结果不理想的原因：
★蛋白提取的裂解液中，目的蛋白含量太低
一些蛋白在组织中的蛋白含量很低（例如转录因子等核蛋白，gpcr、cd分子等膜蛋白），如果提取蛋白的时候没有做到富集，往往后续wb显色的时候会导致背景很脏，甚至导致白板的出现。这时候需要专门的蛋白富集提取方法来提取蛋白，例如相对于全细胞或全组织裂解物来说，核表达蛋白在细胞核裂解物总蛋白中占有相当大的比例，这样凝胶条带中可以载入更多的目的蛋白。另一个优点是排除了杂质成分潜在的交叉反应。浓缩使信号大化（例如检测核蛋白要用核裂解物）。
如上图结果所示，使用特定的蛋白提取试剂盒提取蛋白，可以有效的富集特定细胞组分，保证目的蛋白的上样量。
注：实验中使用gapdh(m20006)分析细胞浆蛋白提取物，使用atpase(t40109)分析细胞膜蛋白提取物，使用histone(p30266)分析细胞核蛋白提取物。
膜蛋白产品提取试剂盒货号：a10008，核蛋白产品提取试剂盒货号：a10009
★ 蛋白提取后出现降解
在蛋白质的提取过程中，蛋白酶在细胞或组织裂解后释放，降解蛋白质样品，从而降低蛋白质样品的量。这样往往导致后续实验中检测不到目的蛋白或蛋白降解带明显出现。为防止蛋白质被蛋白酶所降解，要加入特异性的蛋白酶抑制剂来抑制蛋白酶活性。很多同学在实验过程中也加入了蛋白酶抑制剂，但是为什么还会出现蛋白降解呢？主要原因是很多同学往往只加入了一种蛋白酶的抑制剂，但是蛋白酶是有非常多种类的，每一种蛋白酶均需要一种特定的蛋白酶抑制剂来抑制其蛋白酶活性。所以为了防止蛋白降解，需要加入各种蛋白酶抑制剂。
方便的做法是购买现成的cocktail形式的蛋白酶抑制剂，这种蛋白酶抑制剂是将常用的数种蛋白酶抑制剂混合到一起，制备成了即用型的试剂产品，用起来很是方便。
abmart提供了一款cocktail形式的蛋白酶抑制剂，可以有效地防止蛋白提取过程中的蛋白降解问题。a10004，200x蛋白酶抑制剂复合物（200x protease inhibitorcocktail）【同sigma p1860】。
电泳转膜
对于较大分子量的蛋白（大于100 kda），电泳转膜这个步骤是很容易出现问题的，主要是包括以下几个方面：
1. 对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心。
2. 大蛋白易在凝胶里形成沉淀，从而影响转膜。转膜时在电转移缓冲液加入sds至终浓度0.1%，避免出现这种情况。甲醇易使sds从蛋白上脱失，因此相应降低甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3. 降低电转移缓冲液中甲醇的比例，这样可以促进凝胶的膨胀，更易于大蛋白的转出。
4. 只有使用硝酸纤维素膜时，甲醇才是必需的。如果是pvdf膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前pvdf需用甲醇活化。
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