高压细胞破碎仪厂家指导如何提取高质量的RNA
高压细胞破碎仪厂家指导提取高质量的rna的步骤如下：
1、细胞裂解
细胞的获取方式不同，采用的裂解方法也不尽相同。
若是组织中提取，按照每50-100mg样品加入1ml trizol的比例加入trizol，而后匀浆破碎样品。细胞破碎后在室温下静置5分钟，这样可以分离出核蛋白复合物（nucleoprotein complexes），然后离心去除细胞碎片。
若是培养瓶中贴壁细胞，则先用冰pbs洗2次，而后按每10平方厘米区域加入1ml trizol的比例加入trizol, 吹打混匀处理。
若是悬浮细胞，离心收集细胞，去除培养基，然后加入适量trizol吹打混匀处理。
可以发现这步操作主要用到了trizol这个试剂。trizol的主要成分是，是有效的蛋白变性剂。它能够抑制酶活性包括rnaaes，这样可以保证rna不会被降解掉，同时trizol能够使细胞裂解。
2、抽提rna
向ep管中的细胞液加入200ul氯仿，涡旋15秒后，室温静置3分钟，然后4℃，12000rpm,15min条件下离心。离心后分3层，上层为无色或淡粉色含有rna，中层为白色含有dna，下层为红色含有蛋白质和脂质。我们所需的rna由于氯仿的作用就分在上层的水相中。
氯仿是有机溶剂，添加氯仿会使细胞内的蛋白变性沉淀，可以通过离心进行去除。同时加入氯仿后，水相和有机相会分层，将水相中的酚抽提以免损伤核酸，另外还能溶解一些脂溶性杂质纯化rna。
3、沉淀rna
吸取上层水相于新的ep管中，不要吸取中间层或下层的部分，加入等体积的异丙醇，一般是500ul上清和500ul异丙醇，少的时候可以取200ul的上清。两者充分混匀，室温放置10分钟,然后4℃，12000rpm离心10分钟。离心结束后，弃去上清，管底可见白色胶状沉淀，这就是rna了。
4、洗涤rna
为了进行rna的洗涤，需要用depc水配制75%的乙醇溶液，现配现用。depc水就是是用depc(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的miliq纯水，里面不含杂质rna，dna和蛋白质。
按照添加的trizon的量1:1体积配乙醇溶液，一般是750ul分析纯乙醇加上250ul depc水，在涡旋仪上使乙醇溶液与rna充分混匀，4℃，9000rpm,5min离心。然后小心弃去上清，不要吸走管底的rna哦。
5、再次洗涤rna
重复第四步骤，再次洗涤rna，弃去上清后，控干ep管。室温下将ep管倒置在吸水纸上5-10min,酌情加入20-50ul depc水溶解rna，这就是我们终提取到的rna了。
6、测定rna纯度&浓度
用微量紫外分光光度计取1-2ul rna检测即可。a260/a280值在1.8-2.0间符合纯度。rna在260nm处有大吸收，a260=1.0代表rna的浓度为40ug/ml。a280用于检测蛋白污染，纯rna样品的a260/a280=2.1，一般所得比值在1.8-2.0间也是普遍认可的。另外，我们也可以测定a230。a230用于检测其他污染，主要来自rna提取试剂，理想的a230值要大于1.5。另外rna的完整性可以用1%的琼脂糖凝胶电泳验证。
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若是组织中提取，按照每50-100mg样品加入1ml trizol的比例加入trizol，而后匀浆破碎样品。细胞破碎后在室温下静置5分钟，这样可以分离出核蛋白复合物（nucleoprotein complexes），然后离心去除细胞碎片。
若是培养瓶中贴壁细胞，则先用冰pbs洗2次，而后按每10平方厘米区域加入1ml trizol的比例加入trizol, 吹打混匀处理。
若是悬浮细胞，离心收集细胞，去除培养基，然后加入适量trizol吹打混匀处理。
可以发现这步操作主要用到了trizol这个试剂。trizol的主要成分是，是有效的蛋白变性剂。它能够抑制酶活性包括rnaaes，这样可以保证rna不会被降解掉，同时trizol能够使细胞裂解。
2、抽提rna
向ep管中的细胞液加入200ul氯仿，涡旋15秒后，室温静置3分钟，然后4℃，12000rpm,15min条件下离心。离心后分3层，上层为无色或淡粉色含有rna，中层为白色含有dna，下层为红色含有蛋白质和脂质。我们所需的rna由于氯仿的作用就分在上层的水相中。
氯仿是有机溶剂，添加氯仿会使细胞内的蛋白变性沉淀，可以通过离心进行去除。同时加入氯仿后，水相和有机相会分层，将水相中的酚抽提以免损伤核酸，另外还能溶解一些脂溶性杂质纯化rna。
3、沉淀rna
吸取上层水相于新的ep管中，不要吸取中间层或下层的部分，加入等体积的异丙醇，一般是500ul上清和500ul异丙醇，少的时候可以取200ul的上清。两者充分混匀，室温放置10分钟,然后4℃，12000rpm离心10分钟。离心结束后，弃去上清，管底可见白色胶状沉淀，这就是rna了。
4、洗涤rna
为了进行rna的洗涤，需要用depc水配制75%的乙醇溶液，现配现用。depc水就是是用depc(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的miliq纯水，里面不含杂质rna，dna和蛋白质。
按照添加的trizon的量1:1体积配乙醇溶液，一般是750ul分析纯乙醇加上250ul depc水，在涡旋仪上使乙醇溶液与rna充分混匀，4℃，9000rpm,5min离心。然后小心弃去上清，不要吸走管底的rna哦。
5、再次洗涤rna
重复第四步骤，再次洗涤rna，弃去上清后，控干ep管。室温下将ep管倒置在吸水纸上5-10min,酌情加入20-50ul depc水溶解rna，这就是我们终提取到的rna了。
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用微量紫外分光光度计取1-2ul rna检测即可。a260/a280值在1.8-2.0间符合纯度。rna在260nm处有大吸收，a260=1.0代表rna的浓度为40ug/ml。a280用于检测蛋白污染，纯rna样品的a260/a280=2.1，一般所得比值在1.8-2.0间也是普遍认可的。另外，我们也可以测定a230。a230用于检测其他污染，主要来自rna提取试剂，理想的a230值要大于1.5。另外rna的完整性可以用1%的琼脂糖凝胶电泳验证。
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