免疫细胞培养技术的介绍
免疫细胞（immune cells）是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等，其在免疫细胞疗法中扮演着至关重要的角色。
简介
免疫细胞按照来源，可分为髓系和淋巴两类。
髓系免疫细胞（myeloid immune cells）起源于骨髓，并包括多种类型的细胞，如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜酸粒细胞等。这些细胞在免疫系统中具有重要的功能，包括吞噬病原体、产生炎症反应和抗原呈递等。
淋巴细胞（lymphoid immune cells）起源于骨髓，并在淋巴组织（如脾脏、淋巴结和扁桃体）中发挥重要的免疫功能。它们包括t细胞、b细胞和自然杀伤细胞等。
培养方法
2.1样本采集与预处理
外周血来源的pbmc是分离特定免疫细胞亚群的一个常见方法。具体为外周血采集后，装入含有适宜抗凝剂的无菌容器中防止凝集，其中要求外周血与抗凝剂轻柔混匀。目前，常用的抗凝剂有肝素、edta和枸橼酸钠等。适合于后期免疫细胞培养的抗凝剂常用是肝素。
2.2样本制备
单个核细胞（pbmc）的获取：制备方法为常用ficoll密度梯度离心法。具体方法如下：
①将10ml外周血转入50ml离心管中，加入10ml pbs溶液稀释，轻轻混匀；
②取两支15ml离心管，先加入5ml ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
③900g，离心30min，升1降1。
④离心完成后，依次从上而下，分别收集血浆（微黄色层）、单个核细胞（白膜层）。
⑤单个核细胞（白膜层）加入1-2倍的pbs，400g，离心10min后去掉上清，再加入1640培养基进行相同操作的清洗。
2.3细胞培养
加入培养液1ml重悬细胞，混匀计数，按照计数结果调整细胞密度为3-10x105细胞/ml进行铺板培养。详细培养添加主要组分如下：
（1）cd8+细胞培养从人外周血单个核细胞中用il-2、cd3/cd28激活剂体外激活和扩增cd8+细胞。
il-2对cd8/ctl的扩增、存活和功能至关重要【1-2】。
离体产生记忆干t细胞的方法依赖于cd3 / cd28共刺激以及使用诸如il-7和il-15之类的细胞因子【3】。
（2）nk细胞培养
从人外周血单个核细胞中用il-2、il-15、 il-12 、il-18等体外激活和扩增nk细胞【4】。
nk细胞的杀伤活性，需要在细胞培养基中添加一些刺激剂，如il-2、il-15等。il-2和il-15的加入可以促进nk细胞的增殖和分化，同时提高细胞的杀伤活性。促进nk细胞的生长和扩增。在一些研究中，还会添加一些其他的细胞因子，如白细胞介素-12（il-12）、白细胞介素-18（il-18）等，以提高nk细胞的细胞毒性和杀伤作用。
（3）dc细胞培养
从人外周血单个核细胞中用gm-csf、il-4和tnf-α体外诱导扩增dc细胞。
gm-csf，il-4和tnf-α培养系统中人单核细胞衍生树突状细胞（单dc）的粘附和非粘附细胞的纯度，表型，抗原摄取能力和t淋巴细胞刺激能力。结果表明，粘附dc的纯度和抗原摄取能力均显着高于非粘附dc【5】。
（4）巨噬细胞培养
从人外周血单个核细胞中用gm-csf、m-csf体外诱导扩增巨噬细胞。
m1和m2巨噬细胞可以被人重组gm-csf和m-csf诱导【6】。
3.应用
免疫细胞不仅可以消灭癌细胞，还可消灭传染病和自身免疫疾病【7】。
4.参考文献
【1】kalia v, sarkar s. regulation of effector and memory cd8 t cell differentiation by il-2-a balancing act. front immunol. 2018 dec 20;9:2987. doi: 10.3389/fimmu.2018.02987. pmid: 30619342; pmcid: pmc6306427.
【2】noto a, ngauv p, trautmann l. cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. j vis exp. 2013 dec 17;(82):e51105. doi: 10.3791/51105. pmid: 24378436; pmcid: pmc4111270.
【3】alvarez-fernández c, escribà-garcia l, vidal s, sierra j, briones j. a short cd3/cd28 costimulation combined with il-21 enhance the generation of human memory stem t cells for adoptive immunotherapy. j transl med. 2016 jul 19;14(1):214. doi: 10.1186/s12967-016-0973-y. pmid: 27435312; pmcid: pmc4952071.
【4】lauwerys br, garot n, renauld jc, houssiau fa. cytokine production and killer activity of nk/t-nk cells derived with il-2, il-15, or the combination of il-12 and il-18. j immunol. 2000 aug 15;165(4):1847-53. doi: 10.4049/jimmunol.165.4.1847. pmid: 10925263.
【5】yi hj, lu gx. adherent and non-adherent dendritic cells are equivalently qualified in gm-csf, il-4 and tnf-α culture system. cell immunol. 2012 may-jun;277(1-2):44-8. doi: 10.1016/j.cellimm.2012.05.014. epub 2012 jun 7. pmid: 22763269.
【6】yamane k, leung kp. rabbit m1 and m2 macrophages can be induced by human recombinant gm-csf and m-csf. febs open bio. 2016 aug 15;6(9):945-53. doi: 10.1002/2211-5463.12101. pmid: 27642558; pmcid: pmc5011493.
【7】weber ew, maus mv, mackall cl. the emerging landscape of immune cell therapies. cell. 2020 apr 2;181(1):46-62. doi: 10.1016/j.cell.2020.03.001. pmid: 32243795; pmcid: pmc8900215.
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简介
免疫细胞按照来源，可分为髓系和淋巴两类。
髓系免疫细胞（myeloid immune cells）起源于骨髓，并包括多种类型的细胞，如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜酸粒细胞等。这些细胞在免疫系统中具有重要的功能，包括吞噬病原体、产生炎症反应和抗原呈递等。
淋巴细胞（lymphoid immune cells）起源于骨髓，并在淋巴组织（如脾脏、淋巴结和扁桃体）中发挥重要的免疫功能。它们包括t细胞、b细胞和自然杀伤细胞等。
培养方法
2.1样本采集与预处理
外周血来源的pbmc是分离特定免疫细胞亚群的一个常见方法。具体为外周血采集后，装入含有适宜抗凝剂的无菌容器中防止凝集，其中要求外周血与抗凝剂轻柔混匀。目前，常用的抗凝剂有肝素、edta和枸橼酸钠等。适合于后期免疫细胞培养的抗凝剂常用是肝素。
2.2样本制备
单个核细胞（pbmc）的获取：制备方法为常用ficoll密度梯度离心法。具体方法如下：
①将10ml外周血转入50ml离心管中，加入10ml pbs溶液稀释，轻轻混匀；
②取两支15ml离心管，先加入5ml ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
③900g，离心30min，升1降1。
④离心完成后，依次从上而下，分别收集血浆（微黄色层）、单个核细胞（白膜层）。
⑤单个核细胞（白膜层）加入1-2倍的pbs，400g，离心10min后去掉上清，再加入1640培养基进行相同操作的清洗。
2.3细胞培养
加入培养液1ml重悬细胞，混匀计数，按照计数结果调整细胞密度为3-10x105细胞/ml进行铺板培养。详细培养添加主要组分如下：
（1）cd8+细胞培养从人外周血单个核细胞中用il-2、cd3/cd28激活剂体外激活和扩增cd8+细胞。
il-2对cd8/ctl的扩增、存活和功能至关重要【1-2】。
离体产生记忆干t细胞的方法依赖于cd3 / cd28共刺激以及使用诸如il-7和il-15之类的细胞因子【3】。
（2）nk细胞培养
从人外周血单个核细胞中用il-2、il-15、 il-12 、il-18等体外激活和扩增nk细胞【4】。
nk细胞的杀伤活性，需要在细胞培养基中添加一些刺激剂，如il-2、il-15等。il-2和il-15的加入可以促进nk细胞的增殖和分化，同时提高细胞的杀伤活性。促进nk细胞的生长和扩增。在一些研究中，还会添加一些其他的细胞因子，如白细胞介素-12（il-12）、白细胞介素-18（il-18）等，以提高nk细胞的细胞毒性和杀伤作用。
（3）dc细胞培养
从人外周血单个核细胞中用gm-csf、il-4和tnf-α体外诱导扩增dc细胞。
gm-csf，il-4和tnf-α培养系统中人单核细胞衍生树突状细胞（单dc）的粘附和非粘附细胞的纯度，表型，抗原摄取能力和t淋巴细胞刺激能力。结果表明，粘附dc的纯度和抗原摄取能力均显着高于非粘附dc【5】。
（4）巨噬细胞培养
从人外周血单个核细胞中用gm-csf、m-csf体外诱导扩增巨噬细胞。
m1和m2巨噬细胞可以被人重组gm-csf和m-csf诱导【6】。
3.应用
免疫细胞不仅可以消灭癌细胞，还可消灭传染病和自身免疫疾病【7】。
4.参考文献
【1】kalia v, sarkar s. regulation of effector and memory cd8 t cell differentiation by il-2-a balancing act. front immunol. 2018 dec 20;9:2987. doi: 10.3389/fimmu.2018.02987. pmid: 30619342; pmcid: pmc6306427.
【2】noto a, ngauv p, trautmann l. cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. j vis exp. 2013 dec 17;(82):e51105. doi: 10.3791/51105. pmid: 24378436; pmcid: pmc4111270.
【3】alvarez-fernández c, escribà-garcia l, vidal s, sierra j, briones j. a short cd3/cd28 costimulation combined with il-21 enhance the generation of human memory stem t cells for adoptive immunotherapy. j transl med. 2016 jul 19;14(1):214. doi: 10.1186/s12967-016-0973-y. pmid: 27435312; pmcid: pmc4952071.
【4】lauwerys br, garot n, renauld jc, houssiau fa. cytokine production and killer activity of nk/t-nk cells derived with il-2, il-15, or the combination of il-12 and il-18. j immunol. 2000 aug 15;165(4):1847-53. doi: 10.4049/jimmunol.165.4.1847. pmid: 10925263.
【5】yi hj, lu gx. adherent and non-adherent dendritic cells are equivalently qualified in gm-csf, il-4 and tnf-α culture system. cell immunol. 2012 may-jun;277(1-2):44-8. doi: 10.1016/j.cellimm.2012.05.014. epub 2012 jun 7. pmid: 22763269.
【6】yamane k, leung kp. rabbit m1 and m2 macrophages can be induced by human recombinant gm-csf and m-csf. febs open bio. 2016 aug 15;6(9):945-53. doi: 10.1002/2211-5463.12101. pmid: 27642558; pmcid: pmc5011493.
【7】weber ew, maus mv, mackall cl. the emerging landscape of immune cell therapies. cell. 2020 apr 2;181(1):46-62. doi: 10.1016/j.cell.2020.03.001. pmid: 32243795; pmcid: pmc8900215.
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