外泌体miRNA可通过细胞衰老途径参与结肠炎发生？
外泌体是直径为30-200nm的小囊泡，几乎来自所有细胞[1]。外泌体中包裹了rna、dna、蛋白质和脂质，通过在不同细胞之间的传递，介导多种生理和病理过程。作为小的非编码单链rna，micrornas (mirnas)通过转录后抑制基因表达，显著调节细胞生长和代谢，可以被包装在外泌体中以防止rnase的消化并进入循环，可作为潜在的疾病生物标志物[2]。
图1外泌体mirna分泌机制
2023年8月7日，武汉大学人民医院董卫国教授团队在国际学术期刊gut microbes在线发表了题为“exosomal-mir-129-2-3p derived from fusobacterium nucleatum-infected intestinalepithelial cells promotes experimental colitisthrough regulating timeless-mediated cellular senescence pathway”研究性论文（if 12.2）。该研究揭示了具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum，fn)通过外泌体加重溃疡性结肠炎(uc)的分子机制，为uc的诊断和靶向治疗提供了新的理论支持。
图2文章信息
核梭杆菌(fn)感染可加剧溃疡性结肠炎(uc)。然而，fn感染的肠上皮细胞(iec)衍生外泌体(fn-exo)与uc进展之间的联系尚未被研究。该研究通过mirna测序鉴定了fn-exo和未感染的iec衍生外泌体(con-exo)中差异表达的mirna。然后，在体外和体内确定fn-exo在uc发育中的生物学作用和机制。作者发现外泌体将mir-129-2-3p从fn感染的iecs传递到未感染的iecs，加剧上皮屏障功能障碍和实验性结肠炎。机制上，fn-exo通过mir-129-2-3p/timeless轴诱导dna损伤，随后激活atm/atr/p53通路，最终促进细胞衰老和结肠炎症。总之，exo-mir-129-2-3p/timeless/atm/atr/p53通路加重了细胞衰老、屏障损伤和实验性结肠炎。目前的研究揭示了fn感染性uc进展中的一个前所未知的调控途径。此外，血清中的外泌体-mir-129-2-3p可能作为uc和fn-high-uc的新型潜在诊断生物标志物[3]。
图3 fn-exo在结肠炎中的作用和机制示意图
一、爱必信拥有全套的外泌体&mirna解决方案
图4 爱必信外泌体&mirna解决方案
1、mirna提取
一般来说，传统的trizol及其它常用的rna提取试剂盒提取的是较大分子的rna，包括rrna和mrna，但对mirna的提取效果不佳。这可能是因为如此小的核酸分子不易被醇类沉淀、也不易被核酸纯化膜和磁珠吸附捕捉的原因。因而，要较好地提取mirna，必须采取一些新的思路和方法。根据目前的研究结果显示，mirna富集法应该是一种不错的选择。其原理为，先使用富集试剂将含量较低、分子量较小的mirna聚集在一起，再使用核酸纯化柱进行提取。显然，mirna聚集后更加有利于mirna的吸附和捕捉，从而得以有效地提升mirna的提取得率。
爱必信研发了可高效提取各样本中mirna的专门试剂盒，与部分同类试剂盒相比，显著提升了mirna的提取效率。
1）采用特殊的消化技术，去除较大分子的dna和rrna, 使mirna更容易分离提取
2）采用mirna富集技术，使mirna聚集起来，使之更容易被核酸纯化膜吸附纯化，大幅提升mirna的提取效率；
3）操作简便，只需30多分钟即可获得理想的mirna提取结果。
货号
产品名称
规格
abs60262
细胞mirna提取试剂盒
30t/60t
abs60260
血液mirna提取试剂盒
30t/60t
abs60261
组织mirna提取试剂盒
30t/60t
abs60263
外泌体rna提取试剂盒
50t/100t
abs60264
血浆血清mirna提取试剂盒
50t/100t
2、mirna逆转录&qpcr
mirna逆转录的难点在于其分子较小，逆转录引物无法理想地与mirna结合。显然，进行mirna逆转录时，需要对mirna分子进行加长改造。有两种方法可达到这一目的：一种采用poly(a)加尾法，另一种采用茎环法。对于加尾法逆转录来说，mirna能否有效加长的关键在于poly(a)聚合酶的活性。poly(a)聚合酶活性高，就可以在短时间内给mirna加上较长的poly(a)尾巴，使mirna分子能够高效地结合oligo(dt)引物。另外oligo(dt)引物的设计也至关重要，如果是简单的oligo(dt)，引物与mirna的结合往往会发生错位，导致逆转录效率降低。高效的oligo(dt)引物应该加入锚定碱基，从而使二者的结合更加特异高效。茎环法逆转录成功的关键在于茎环的设计，该茎环应能高效地与mirna 3’端特异、高效地结合，同时还要能够顺利地折叠和打开。
mirna qpcr相对较为简单，主要有染料法和探针法。两种方法相比，探针法特异性更强。不过如果mirna能够高效提取，并且mirna qpcr逆转录成功，无论mirna qpcr选择何种方法，一般都会有较为理想的结果。
二、加尾法逆转录vs颈环法逆转录如何选择？
选择何种mirna逆转录以及定量方法，主要由实验来决定。对于从事较多mirna（3个以上）研究的研究者来说，选用加尾法逆转录试剂盒较好，因为一次逆转录后可以进行多个mirna的qpcr扩增，省去了很多的实验操作。但对于只检测1-2个mirna的研究者来说，选用茎环法比较合适，因为茎环法逆转录结果更加特异。
货号
产品名称
规格
加尾染料法
abs60265
mirna加尾法逆转录试剂盒
20t/40t
abs60266
mirna加尾法逆转录试剂盒（血浆）
25t/50t
abs60271
mirna加尾染料法荧光定量pcr试剂盒
200t/300t/400t
探针法
abs60267
mirna探针法逆转录试剂盒
20t/40t
abs60268
mirna探针法逆转录试剂盒（血浆）
20t/40t
abs60272
mirna探针法荧光定量pcr试剂
100t/200t/400t
茎环染料法
abs60269
mirna茎环法逆转录试剂盒
25t/50t
abs60270
mirna茎环染料法荧光定量pcr试剂盒
200t/400t
需要特别注意的是，mirna逆转录试剂盒和mirna qpcr试剂盒一般是配套使用的，研究者最好买我公司配套的mirna逆转录试剂和qpcr试剂，否则，有可能出现实验失败。其主要原因是逆转录引物上往往设计有qpcr引物结合序列，如果买不同厂家的试剂，qpcr引物可能无法特异地结合逆转录产物。另外，对于初学者而言，mirna上游引物的设计有一定难度，往往既花了时间，又得不到好的实验结果，建议最好购买能够赠送上游引物的逆转录试剂生产厂家。
1）凡购买mirna逆转录和定量试剂盒一套，即可免费获得逆转录&qpcr引物；
2）凡购买mirna逆转录和定量试剂盒一套支持mirna引物定制合成服务。
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货号
产品名称
规格
abs993
无外泌体胎牛血清
50ml
abs9430
外泌体专用无血清培养基
500ml
abs9587
外泌体专用裂解液
20ml
abs60364
外泌体dna提取试剂盒
50t/100t
abs60263
外泌体rna提取试剂盒
50t/100t
abs50040
细胞上清外泌体提取试剂盒
20t
abs50039
血浆血清外泌体提取试剂盒
20t
参考文献
[1] pegtel dm, gould sj. exosomes. annu rev biochem. 2019;88:487–514. doi: 10.1146/annurev-biochem-013118-111902.
[2] jeppesen dk, fenix am, franklin jl, higginbotham jn, zhang q, zimmerman lj, liebler dc, ping j, liu q, evans r, et al. reassessment of exosome composition. cell. 2019;177(2):428–445.e18. doi: 10.1016/j.cell.2019.02.029.
[3] wei s, wu x, chen m, xiang z, li x, zhang j, dong w. exosomal-mir-129-2-3p derived from fusobacterium nucleatum-infected intestinal epithelial cells promotes experimental colitis through regulating timeless-mediated cellular senescence pathway. gut microbes. 2023 jan-dec;15(1):2240035. doi: 10.1080/19490976.2023.2240035. pmid: 37550944; pmcid: pmc10411316.
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wb相关：ecl发光液、预染marker、预制胶；ihc相关：二抗试剂盒、组化笔；ip/coip试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、bsa、蛋白酶k、ctb、ttx、cee；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；elisa试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
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1、mirna提取
一般来说，传统的trizol及其它常用的rna提取试剂盒提取的是较大分子的rna，包括rrna和mrna，但对mirna的提取效果不佳。这可能是因为如此小的核酸分子不易被醇类沉淀、也不易被核酸纯化膜和磁珠吸附捕捉的原因。因而，要较好地提取mirna，必须采取一些新的思路和方法。根据目前的研究结果显示，mirna富集法应该是一种不错的选择。其原理为，先使用富集试剂将含量较低、分子量较小的mirna聚集在一起，再使用核酸纯化柱进行提取。显然，mirna聚集后更加有利于mirna的吸附和捕捉，从而得以有效地提升mirna的提取得率。
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1）采用特殊的消化技术，去除较大分子的dna和rrna, 使mirna更容易分离提取
2）采用mirna富集技术，使mirna聚集起来，使之更容易被核酸纯化膜吸附纯化，大幅提升mirna的提取效率；
3）操作简便，只需30多分钟即可获得理想的mirna提取结果。
货号
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30t/60t
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外泌体rna提取试剂盒
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血浆血清mirna提取试剂盒
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2、mirna逆转录&qpcr
mirna逆转录的难点在于其分子较小，逆转录引物无法理想地与mirna结合。显然，进行mirna逆转录时，需要对mirna分子进行加长改造。有两种方法可达到这一目的：一种采用poly(a)加尾法，另一种采用茎环法。对于加尾法逆转录来说，mirna能否有效加长的关键在于poly(a)聚合酶的活性。poly(a)聚合酶活性高，就可以在短时间内给mirna加上较长的poly(a)尾巴，使mirna分子能够高效地结合oligo(dt)引物。另外oligo(dt)引物的设计也至关重要，如果是简单的oligo(dt)，引物与mirna的结合往往会发生错位，导致逆转录效率降低。高效的oligo(dt)引物应该加入锚定碱基，从而使二者的结合更加特异高效。茎环法逆转录成功的关键在于茎环的设计，该茎环应能高效地与mirna 3’端特异、高效地结合，同时还要能够顺利地折叠和打开。
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货号
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加尾染料法
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20t
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参考文献
[1] pegtel dm, gould sj. exosomes. annu rev biochem. 2019;88:487–514. doi: 10.1146/annurev-biochem-013118-111902.
[2] jeppesen dk, fenix am, franklin jl, higginbotham jn, zhang q, zimmerman lj, liebler dc, ping j, liu q, evans r, et al. reassessment of exosome composition. cell. 2019;177(2):428–445.e18. doi: 10.1016/j.cell.2019.02.029.
[3] wei s, wu x, chen m, xiang z, li x, zhang j, dong w. exosomal-mir-129-2-3p derived from fusobacterium nucleatum-infected intestinal epithelial cells promotes experimental colitis through regulating timeless-mediated cellular senescence pathway. gut microbes. 2023 jan-dec;15(1):2240035. doi: 10.1080/19490976.2023.2240035. pmid: 37550944; pmcid: pmc10411316.
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