细胞转染的最quan知识介绍，收藏这一篇就够了
定义：细胞转染是指将外源分子如dna，rna等导入真核细胞的技术。
应用：在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中。
简介：转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
一、转染的途径大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类：
1.物理介导：电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例。
2.化学介导：方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术。
3.生物介导：方法有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效lvzui高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最you的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
二、常规转染技术：
1.瞬时转染（transient transfection）：外源dna/rna不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒dna转染效率较高，在转染后24~72h小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统和荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
2.稳定转染（stable transfected）：外源dna既可以整合到宿主细胞中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性dna比超螺旋dna转入量低但整合率高。外源dna整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记。如来氨丙基转移酶（aph；新mei素抗性基因），潮霉素磷酸转移酶（hph），胸苷激酶（tk）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
瞬时转染和稳定转染的比较
三、转染方式
细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成，这对大分子物质来说是个不可透过的屏障，比如dna和rna的磷酸骨架，其也带负电荷。为了使核酸穿过细胞膜，研究人员开发了多种技术，大致分为三类：化学方法---利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷。生物方法---利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中。物理方法---在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入dna。然而，没有一种方法适用于所有的细胞和实验，理想的方法应根据您的细胞类型和实验需要进行选择，理想的方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和可重复性等特点。
化学转染方法
技术优点缺点
阳离子脂质体1.操作快速简单。2.结果可重复。3.转染效率高。4.可转染dna，rna和蛋白质。5.适用于生产瞬时和稳定的蛋白质。6.可用于体内转染。1.需进行条件优化(一些细胞系对阳离子脂质体较敏感)。2.有些细胞系不容易转染。3.血清的存在干扰复合物的形成，导致低转染效率。4.培养基中血清的缺失会增加细胞毒性。
磷酸钙共沉淀1.便宜且容易获得。2.适用于生产瞬时和稳定的蛋白质。3.转染效率高（不限制细胞系）。1.需要仔细制备试剂–capo4溶液对ph，温度和缓冲盐浓度的变化敏感。2.可重复性较差。3.有细胞毒性，尤其对原代细胞。4.不能采用rpmi培养基，由于其含高浓度的磷酸盐。5.不适用于动物体内转染。
葡聚糖1.操作简单。2.结果可重复。3.便宜。1.对某些细胞有化学毒性。2.只限于瞬时转染。3.转染效率低，尤其在原代细胞中。
其他阳离子聚合物1.在血清中稳定，对温度不敏感。2.高转染效率（限制细胞系）。3.结果可重复。1.对某些细胞有毒性。2.不能生物降解（树枝状大分子）。3.只限于瞬时转染。
生物转染方法
病毒转染1.高转染效率（对原代细胞有80-90%）。2.适用于较难转染的细胞系。3.可用于体内转染。4.可用于构建稳定表达或瞬时表达的细胞系。1.被转染的细胞系必须含有bing毒受体。2.基因插入大小受限（病毒载体~10 kb，非病毒载体~100 kb）。3.技术难度高，且构建重组蛋白很费时。4.存在生物安全问题（激活潜在疾病，免疫原性反应，细胞毒性，插入突变，使细胞恶性转化）。
物理转染方法
电转1.原理简单。2.条件优化后可产生重复性的结果。3.不需要载体。4.不限制细胞类型和条件。5.条件优化后可以快速转染大量细胞。1.需要特殊的设备。2.需要优化电转脉冲和电压参数。3.对细胞伤害很大。4.细胞死亡率很高因此需要大量细胞会不可逆转地损坏细胞膜，溶解细胞。
生物传递粒子传递（粒子轰击）1.不限制细胞类型和条件。2.可用于动物体内转染。3.方法直接，结果可靠。4.不限制导入基因的大小和数量。5.主要用于基因疫苗和农业应用。1.需要昂贵的设备2.会对样品产生物理损伤3.细胞死亡率很高因此需要大量细胞4.需要准备微粒5.转染效率相对较低6.对于研究应用成本较昂贵
显微注射1.不限制细胞类型和条件。2.可以单细胞转染。3.方法直接，结果可靠。4.不限制导入基因的大小和数量5.不需要载体。1.需要昂贵的设备。2.有技术要求，且是劳动密集型（一次只能转染一个细胞）。3.常引起细胞死亡。
激光介导的转染（光转染）1.可用于转染dna，rna，蛋白质，离子，葡聚糖，小分子和半导体纳米晶体。2.可用于非常小的细胞。3.允许单细胞转染或同时转染大量细胞。4.不需要载体。5.转染效率高。6.适用于多种细胞系。1.需要昂贵的激光显微镜系统。2.需要贴壁细胞。3.有技术要求。
四、部分转染方法的原理及步骤：
1、阳离子脂质体介导的转染
原理：阳离子脂质体介导的转染是目前最chang用的转染方式之一。阳离子脂质的基本结构由带正电荷的头基和一个或两个烃链组成，带正电荷的头基与带负电荷的核酸通过静电作用形成复合物，经细胞的内吞作用进入细胞。
实验步骤：将dna，rna，sirna或寡核苷酸和转染试剂分别在不同的管中稀释→将两者混合形成混合物→将形成的混合物加入细胞中，脂质体的正电荷有助于帮助复合物粘附到细胞膜上→复合物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。
2、磷酸钙共沉淀
原理：将dna与氯化钙在磷酸缓冲盐水中混合形成磷酸钙-dna沉淀物，然后将其分散在培养的细胞上，磷酸钙促进共沉淀物中的缩合dna与细胞表面的结合，dna通过内吞作用进入细胞。
实验步骤：将氯化钙和dna混合，以可控的方式加入磷酸缓冲液。→在室温下孵育，以形成极细，可溶的共沉淀微粒→将磷酸钙-dna沉淀物加入细胞中，后者能黏附到细胞膜表面→共沉淀物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。
3、病毒转染
原理：对于用脂质体不能实现转染的细胞，可以采用病毒转染。腺病毒，逆转录病毒和慢病毒载体已广泛用于哺乳动物细胞体内外的基因转染。
实验步骤：通过基因克隆方法获得重组病毒表达载体→转染包装细胞系，扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞（含有bing毒特异性的受体）→从培养基中移除病毒→检测基因表达或沉默情况。
4、电转
原理：利用电脉冲在细胞膜上形成暂时的孔使核酸物质能穿过孔进入细胞。
实验步骤：利用电转缓冲液重悬细胞→对含有核酸，缓冲液，细胞的混合物给予合适的电脉冲→电脉冲在细胞膜上形成电势差，诱导产生暂时的孔使核酸进入细胞→将细胞返回到生长培养基中，使其慢慢恢复→检测基因表达或沉默情况。
5、核转仪
结合电穿孔技术和细胞特异性转染液，通过系统内置优化的转染程序，将外源基因高效导入目标细胞的细胞质中，并可直接入核，整合到细胞染色体中。
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一、转染的途径大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类：
1.物理介导：电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例。
2.化学介导：方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术。
3.生物介导：方法有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效lvzui高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最you的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
二、常规转染技术：
1.瞬时转染（transient transfection）：外源dna/rna不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒dna转染效率较高，在转染后24~72h小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统和荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
2.稳定转染（stable transfected）：外源dna既可以整合到宿主细胞中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性dna比超螺旋dna转入量低但整合率高。外源dna整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记。如来氨丙基转移酶（aph；新mei素抗性基因），潮霉素磷酸转移酶（hph），胸苷激酶（tk）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
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三、转染方式
细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成，这对大分子物质来说是个不可透过的屏障，比如dna和rna的磷酸骨架，其也带负电荷。为了使核酸穿过细胞膜，研究人员开发了多种技术，大致分为三类：化学方法---利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷。生物方法---利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中。物理方法---在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入dna。然而，没有一种方法适用于所有的细胞和实验，理想的方法应根据您的细胞类型和实验需要进行选择，理想的方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和可重复性等特点。
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磷酸钙共沉淀1.便宜且容易获得。2.适用于生产瞬时和稳定的蛋白质。3.转染效率高（不限制细胞系）。1.需要仔细制备试剂–capo4溶液对ph，温度和缓冲盐浓度的变化敏感。2.可重复性较差。3.有细胞毒性，尤其对原代细胞。4.不能采用rpmi培养基，由于其含高浓度的磷酸盐。5.不适用于动物体内转染。
葡聚糖1.操作简单。2.结果可重复。3.便宜。1.对某些细胞有化学毒性。2.只限于瞬时转染。3.转染效率低，尤其在原代细胞中。
其他阳离子聚合物1.在血清中稳定，对温度不敏感。2.高转染效率（限制细胞系）。3.结果可重复。1.对某些细胞有毒性。2.不能生物降解（树枝状大分子）。3.只限于瞬时转染。
生物转染方法
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显微注射1.不限制细胞类型和条件。2.可以单细胞转染。3.方法直接，结果可靠。4.不限制导入基因的大小和数量5.不需要载体。1.需要昂贵的设备。2.有技术要求，且是劳动密集型（一次只能转染一个细胞）。3.常引起细胞死亡。
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四、部分转染方法的原理及步骤：
1、阳离子脂质体介导的转染
原理：阳离子脂质体介导的转染是目前最chang用的转染方式之一。阳离子脂质的基本结构由带正电荷的头基和一个或两个烃链组成，带正电荷的头基与带负电荷的核酸通过静电作用形成复合物，经细胞的内吞作用进入细胞。
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2、磷酸钙共沉淀
原理：将dna与氯化钙在磷酸缓冲盐水中混合形成磷酸钙-dna沉淀物，然后将其分散在培养的细胞上，磷酸钙促进共沉淀物中的缩合dna与细胞表面的结合，dna通过内吞作用进入细胞。
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3、病毒转染
原理：对于用脂质体不能实现转染的细胞，可以采用病毒转染。腺病毒，逆转录病毒和慢病毒载体已广泛用于哺乳动物细胞体内外的基因转染。
实验步骤：通过基因克隆方法获得重组病毒表达载体→转染包装细胞系，扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞（含有bing毒特异性的受体）→从培养基中移除病毒→检测基因表达或沉默情况。
4、电转
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