复制型慢病毒（RCL）的不同检测方案解析
复制型病毒（rcr/rcl）
复制型病毒/病毒载体回复突变（replication competent virus, rcv），可产生于病毒载体制造过程中的所有步骤当中。并且，rcv感染宿主细胞后能随宿主细胞在培养液中增殖、扩增对人体健康具有严重的隐患，是免疫细胞治疗类产品，如car-t产品的主要安全性风险之一。近年来，car-t细胞制备过程中，伴随载体的不断升级优化，重组产生的复制型逆转录病毒/慢病毒(replication competent retrovirus / lentivirus, rcr/rcl)逐渐降低，但产生rcr/rcl的风险隐患至今仍不能排除。由2022年5月发布的《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》指出rcr/rcl检测作为安全性检测在细胞药物的研发和生产过程中至关重要，相关产品不得检出rcr/rcl，可知病毒载体相关产品中，rcr/rcl的检测至关重要。
慢病毒( lentivirus，lv)载体是以人类免疫缺陷ⅰ型病毒( human immunodeficiency virus，hiv-1)为基础发展起来的基因治疗载体，它源于逆转录病毒，但又有所不同。lv与一般的逆转录病毒载体相比较，具有感染能力强、容纳更大目的片段的基因、能感染分裂细胞和非分裂细胞和很少引发免疫反应等优点，目前被选为car-t细胞产品的主要病毒载体。
part2rcl检测方法《car-t细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》一文提到：目前 rcr/rcl 的检测方法主要有指示细胞培养法、elisa法(p24蛋白测定)、pcr/q-pcr法（通过psi-gag或vsv-g聚合酶链反应）和转录酶活性测定法(pert)等。其中，利用指示细胞培养法对生产过程中的病毒（上清液、病毒生产终末期细胞）存在的rcl进行培养扩增，并在培养终点进行重复检测是fda推荐的rcl检测方法。
指示细胞培养法分为2个阶段，初始扩增阶段和指示阶段：初始扩增阶段是将待测样品与c8166-45细胞（人类脐带血淋巴细胞）共培养21天，至少传代5次后收集细胞上清，分别采用elisa法测定培养基中的p24蛋白表达量和与新的c8166-45细胞一起共培养，7 d后采用2种不同原理的方法检测rcl，如elisa、pcr或qpcr(psi-gag／vsv-g pcr，elisa p24，pert)。rcl指示细胞培养法分组和检测如图1和2。
图1.指示细胞共培养分组
图2.rcl检测方法
part3rcl检测方法分析根据现有法规和指导原则可以发现，rcl的检测方法主要包含指示细胞培养法、elisa法、pcr/q-pcr法和pert法。因为指示细胞培养法检测需28天，并且因为阳性对照病毒的性质，要求其需要在p3或者p2实验室环境中进行，致使该方法具有耗时长，环境要求高的特点。相比而言,基于vsv-g序列的q-pcr方法或基于psi-gag序列的pcr方法，因其具有检测时间短、环境条件简单、灵敏度高和可重复性强等优点，被许多car-t申报企业作为快速放行方法。
除却指示细胞培养法，其他3种快速检测rcl的检测方法优缺点如下：
01elisa法(p24蛋白测定)elisa 法(p24 蛋白测定)：适用于由载体生产过程中病毒基因组之间的重组形成rcl的检测。但，对于vsv-g 包膜质粒和来源于其他病毒的 gal-pol 基因功能组件之间发生重组不表达p24蛋白的假型病毒不适用。其优点为适用性广（浓缩载体、终末细胞、血清血浆等多种样本）、灵敏度高和可定量等。
02qpcr/pcr法使用qpcr的方法测定vsv-g基因和pcr方法检测由病毒载体质粒和包装质粒重组产生的psi-gag基因序列，具有灵敏度高，可重复性和操作简单等优点。
03pert法测定逆转录酶活性的方法，它可以用来检测rcl相关的不同结构的逆转病毒，缺点为在某些细胞检测中，存在背景高的现象。
美国fda要求对于采用γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体的产品，需要在整个生产过程及不同阶段进行rcl/rcr检测，针对载体生产用主细胞库、工作细胞库、生产终末细胞、载体上清液及在体外培养超过4天的载体转到细胞进行检测，具体如如图3。针对慢病毒载体使用时rcl的检测，除了金标准——指示细胞培养法，还需要选择2种不同原理的快检方法对其进行补充检测。
图3.rcl/rcr检测阶段
参考文献：
1、fda.chemistry,manufacturing,and control(cmc)information for human gene therapy investigational new drug applications(inds)guidance for industry［s］2020．2、fda.testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up guidance for industry[s].2020.3、briefing document—testing for replication competent retrovirus(rcr)/lentivirus(rcl)in retroviral and lentiviral vector based gene therapy products—revisiting current fda recommendations.4、guideline on quality,non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.[s].20205、国家食品药品监督管理总局.免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）.2022.6、《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》，国家药监局药品审评中心，2022.7、《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》，国家药监局药品审评中心，2022.8、《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》,国家药监局药品审评中心，2022.9、《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》,国家药监局药品审评中心，2022.
10、卢加琪,李倩与何伍,《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则(试行)》解读.中国新药杂志,2023.32(02):第118-122页.
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part2rcl检测方法《car-t细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》一文提到：目前 rcr/rcl 的检测方法主要有指示细胞培养法、elisa法(p24蛋白测定)、pcr/q-pcr法（通过psi-gag或vsv-g聚合酶链反应）和转录酶活性测定法(pert)等。其中，利用指示细胞培养法对生产过程中的病毒（上清液、病毒生产终末期细胞）存在的rcl进行培养扩增，并在培养终点进行重复检测是fda推荐的rcl检测方法。
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图1.指示细胞共培养分组
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