CRISPR系统中如何正确挑选合适的cas酶
2020年，jennifer doudna教授和emmanuelle charpentier博士所发现的crispr-cas9“基因剪刀”被授予诺贝尔化学奖。随后，crispr-cas技术得到快速发展，在很短的时间内完成了由基础理论到初步科学验证，进入到多种不同的应用领域。
在ivd领域，基于crispr-cas为基础所开发的新兴诊断被用于传染病和癌症监测中，并以其快速、便携、经济、高效等特点为分子检测带来革新。让我们一起来总结crispr技术中的几位大主角，cas9、cas12、cas13、cas14蛋白所延伸的分子诊断技术。为行业内的学者、科研人员和工作者带来一些启发。如何选择自己实验中合适的cas蛋白酶本文将要阐述下几种酶的区别。
cas9蛋白
cas9是一种dna内切酶，cas9内切酶必须在向导rna分子的引导下对dna进行切割，这是因为这些向导rna分子含有与靶dna序列互补的序列，称之为pam序列。cas9蛋白精确的平端切割位点位于pam上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。cas9蛋白的hnh结构域负责切割与crrna互补配对的那一条dna链，而ruvc结构域负责切割另外一条非互补dna链。最终在cas9的作用下dna双链断裂（dsb）形成双链dna缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologous recombination)或者非同源末端连接机制(non-homologous end joining)对断裂的dna进行修复，进而实现dna片段的敲除或敲入。
cas9的应用：
cas9含有两个具有切割活性的结构域：hnh结构域和ruvc结构域，其中hnh结构域切割与crrna互补的dna链，而ruvc结构域切割非互补链。ruvc结构域可分为三个亚结构域：ruvc i、ruvc ii和ruvc iii，ruvc i接近于cas9的氨基端，ruvc ii和ruvc iii位于hnh结构域的两侧。仅对cas9中的ruvc i进行突变，具体而言就是让ruvc i的两个关键氨基酸残基中的一个转换成（d10a或h840a），从而得到cas9切口酶（cas9 nickase, cas9n）。这种切口酶不能切割非互补dna链，仅能切割与crrna互补的dna链，能够明显减少脱靶效应，同时保持高效的基因修饰。
通过点突变的方式使cas9的两个结构域ruvc-和hnh-失去活性，其中ruvc催化结构域的第10位天冬氨酸突变为（d10a）以及hnh催化结构域的第840位突变为（h840a），cas9蛋白将失去核酸内切酶活性，形成的dcas9只能在sgrna的介导下结合靶基因，而不具备剪切dna的功能。因此，将dcas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dcas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dcas9与cas9、cas9 nickase的不同之处在于，dcas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组dna造成不可逆转的改变。
cas12蛋白
crispr–cas12a蛋白，以前称为cpf1，是一种内切核酸酶，可以通过向导rna进行编程，以靶向互补的dna序列。在与靶dna结合后，crisprcas12a蛋白在每条靶dna链中诱导切割，产生双链dna断裂。除了诱导靶dna的顺式切割之外，靶dna结合还诱导非靶dna的反式切割。因此，crispr cas12a-rna向导复合物可以提供针对入侵核酸（例如噬菌体和质粒）的序列特异性免疫。类似于crispr/cas9，cas12a已被重新用作原核和真核细胞中可编程基因组编辑和转录控制的遗传工具。此外，其反式切割活性已应用于高灵敏度核酸检测。crispr/cas12a系统的脱靶率将比cas9低得多，并且因为它与cas9的诸多不同，它将能与crispr/cas9互补，从而扩大crispr/cas系统的工具箱，使基于crispr/cas系统的基因编辑技术具有更强的普适性和编辑能力。
cas12b核酸酶（又名c2c1）是依赖于rna介导的内切核酸酶，在靶标dna存在pam的情况下，可特异地切割靶标双链dna。cas12b蛋白比cas9和cas12a更小，且来源于嗜酸耐热菌且切割活性较高的alicyclobacillus acidoterrestris。cas12b的最佳切割反应温度为48℃。和同家族的cas12a类似，cas12b也识别5'-ttn的pam序列，切割dna后也产生粘性末端；然而，cas12b是双rna导向，依赖于crrna和tracrrna（或连接后形成的sgrna）。此外，cas12b不仅可以应用于靶标dsdna的切割，还可以用于靶标核酸的快速检测，详见holmesv2核酸快检技术。
cas13蛋白
cas13蛋白可进一步分为4个亚型，即crispr-cas13a,b,c,d。除了cas13c的相关研究目前还不充分外，另外3中cas蛋白已经有了比较广泛的研究和应用。
cas13a核酸酶（又名c2c2）是依赖于rna介导的rna内切核酸酶。在靶标单链rna存在pfs序 列的情况下，可特异地切割靶标rna。此外，cas13a还具有依赖于靶标单链rna的反式切割活性，可用于开发靶标核酸的快速检测试剂盒。例如，mit的张锋团队便利用cas13a蛋白开发了名为“sherlock”的下一代分子诊断系统。对于细菌而言，cas13a这种反式切割活性是有意义的。若细菌被噬菌体感染，它能够激活程序性细胞死亡或休眠状态，以限制感染在整个群体中的传播。像cas13a一样，cas13b仅需要单个向导rna就能靶向目的序列，此外，cas13b能够同时靶向多个rna转录本。
而此后发现的cas13d，具有更高的效率、更低的脱靶率，更重要的是，cas13d相比其他cas13家族成员具有更小的尺寸，能够更容易包装到病毒载体中，因此具有更好的递送优势和应用前景。
cas14蛋白
除了上述几种具有靶向切割能力的cas蛋白之外，近期发现的cas14也具有类似的功能。
cas14a核酸酶是一种内切核酸酶，其在tracrrna:crrna（或sgrna）的引导下，特异结合并切割靶标ssdna，且无需pam位点。相比于其他的cas蛋白，cas14蛋白的分子量普遍较小（400-700aa）；与cas12类似，cas14a也可以结合靶标核酸并激活其ssdna反式切割活性。研究人员认为，cas14的切割对象是单链dna，而不是双链dna，因此未必是良好的基因组编辑工具。不过，他们认为cas14可用在detectr诊断工具中。
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中文名称
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32108-01
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lbcas12a (cpf1)
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sp-ncas9（h840a）
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sp-ncas9（h840a）
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1 od powder
holmes ssdna reporter (fam)
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5×1 ml
10 × holmes buffer 1
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10 × holmes buffer 2
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5×1 ml
cas9 dilution buffer
tolobio
32012
5×1 ml
cas12 dilution buffer
tolobio
32013
5×1 ml
cas13 dilution buffer
关键词：快速检测试剂
实验室COD氨氮总磷水质分析仪XCJZ-3LY双重防超温保护系统
CS19H热动力式蒸汽疏水器工作原理
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cas9蛋白
cas9是一种dna内切酶，cas9内切酶必须在向导rna分子的引导下对dna进行切割，这是因为这些向导rna分子含有与靶dna序列互补的序列，称之为pam序列。cas9蛋白精确的平端切割位点位于pam上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。cas9蛋白的hnh结构域负责切割与crrna互补配对的那一条dna链，而ruvc结构域负责切割另外一条非互补dna链。最终在cas9的作用下dna双链断裂（dsb）形成双链dna缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologous recombination)或者非同源末端连接机制(non-homologous end joining)对断裂的dna进行修复，进而实现dna片段的敲除或敲入。
cas9的应用：
cas9含有两个具有切割活性的结构域：hnh结构域和ruvc结构域，其中hnh结构域切割与crrna互补的dna链，而ruvc结构域切割非互补链。ruvc结构域可分为三个亚结构域：ruvc i、ruvc ii和ruvc iii，ruvc i接近于cas9的氨基端，ruvc ii和ruvc iii位于hnh结构域的两侧。仅对cas9中的ruvc i进行突变，具体而言就是让ruvc i的两个关键氨基酸残基中的一个转换成（d10a或h840a），从而得到cas9切口酶（cas9 nickase, cas9n）。这种切口酶不能切割非互补dna链，仅能切割与crrna互补的dna链，能够明显减少脱靶效应，同时保持高效的基因修饰。
通过点突变的方式使cas9的两个结构域ruvc-和hnh-失去活性，其中ruvc催化结构域的第10位天冬氨酸突变为（d10a）以及hnh催化结构域的第840位突变为（h840a），cas9蛋白将失去核酸内切酶活性，形成的dcas9只能在sgrna的介导下结合靶基因，而不具备剪切dna的功能。因此，将dcas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dcas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dcas9与cas9、cas9 nickase的不同之处在于，dcas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组dna造成不可逆转的改变。
cas12蛋白
crispr–cas12a蛋白，以前称为cpf1，是一种内切核酸酶，可以通过向导rna进行编程，以靶向互补的dna序列。在与靶dna结合后，crisprcas12a蛋白在每条靶dna链中诱导切割，产生双链dna断裂。除了诱导靶dna的顺式切割之外，靶dna结合还诱导非靶dna的反式切割。因此，crispr cas12a-rna向导复合物可以提供针对入侵核酸（例如噬菌体和质粒）的序列特异性免疫。类似于crispr/cas9，cas12a已被重新用作原核和真核细胞中可编程基因组编辑和转录控制的遗传工具。此外，其反式切割活性已应用于高灵敏度核酸检测。crispr/cas12a系统的脱靶率将比cas9低得多，并且因为它与cas9的诸多不同，它将能与crispr/cas9互补，从而扩大crispr/cas系统的工具箱，使基于crispr/cas系统的基因编辑技术具有更强的普适性和编辑能力。
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cas13蛋白
cas13蛋白可进一步分为4个亚型，即crispr-cas13a,b,c,d。除了cas13c的相关研究目前还不充分外，另外3中cas蛋白已经有了比较广泛的研究和应用。
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cas14蛋白
除了上述几种具有靶向切割能力的cas蛋白之外，近期发现的cas14也具有类似的功能。
cas14a核酸酶是一种内切核酸酶，其在tracrrna:crrna（或sgrna）的引导下，特异结合并切割靶标ssdna，且无需pam位点。相比于其他的cas蛋白，cas14蛋白的分子量普遍较小（400-700aa）；与cas12类似，cas14a也可以结合靶标核酸并激活其ssdna反式切割活性。研究人员认为，cas14的切割对象是单链dna，而不是双链dna，因此未必是良好的基因组编辑工具。不过，他们认为cas14可用在detectr诊断工具中。
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中文名称
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