逆转录PCR的实验步骤

一、实验器具与材料:
1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头:1ml、200μl、20μl
3、匀浆管:5ml
4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个
5、ep管:1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖);1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)
7、量筒:50ml、250ml、500ml
8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml
9、试管架:5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装depc水
11、铝制饭盒:4个
12、塑料小饭盒:1个
13、大瓷缸:2个
14、锡泊纸:一卷
15、卷纸:2卷
16、三角烧瓶:带盖,稍大
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品:(包括枪头、ep管、匀浆管等)
先将depc水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入depc水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(ep管)
2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(depc水泡)(洗净后先泡1‰depc过夜,再烤干)
3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡depc)
三、试剂配制:
1、depc水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰depc水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇:用无水乙醇 depc水配,然后放-20℃保存(其中depc水需先高压)
3、异丙醇:放入棕色瓶中
4、氯仿:放入棕色瓶中
5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制:
1、电泳缓冲液:
tris 54g
硼酸 27.5g
0.5m edta 20ml ph8.0
蒸溜水 1000ml
5×tbe (贮存液)
再将5×tbe稀释10倍成0.5tbe就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液:
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青ff
30%甘油
6×缓冲液,4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制:
1、1.0%: 1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%: 同上,将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的rt-pcr材料:
taq酶(含mgcl2 buffer) 200u 70.00
dntp: 1支
oligo(dt)15: 1 od 40.00 promega
m-mlv: 1支 250.00 promega (buffer)
rnasin: 1支 110
-- -20℃
depc 5g 110.00
trizol 100ml/1瓶 invitrogen life technologies
-- 4℃
marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00
七、引物合成
1. 正义:5′-cacgatggaggggccggactcatc-3′
反义:5′-taaagacctctatgccaacacagt-3′
2、par-4:
正义:5′-gggacctcggaactcaac-3′
反义:5′-tgtatctgcctgggactg-3′
3、退火温度计算:
2(a t) 4(g c)
正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)
4、引物各合成5 od,每od一瓶分装好
5、引物稀释:
加depc水量为(μl)= ? nmol / od × 管上所标od数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、pcr产物电泳
先将1-10μl左右pcr产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10ma,电源100v,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。
九、几个注意点:
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴。
2、rt时,先打开pcr预热30分钟。
3、rna抽提前,打开离心机预冷。

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