和的测定方法（HPLC）
高效液相色谱法
*小检出量分别为va：0.8ng；α-e：91.8ng；γ-e：36.6ng；δ-e：20.6ng。1.原理
食物中的*及*经皂化提取以后，将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用hplc法测定*及*的含量。2.适用范围
gb12388-90 本法适用于各种食物和饲料的测定
3. 仪器
（1） 高压液相色谱仪（带紫外检测器）
（2） 六孔恒温水浴锅
（3） 旋转蒸发器
（4） 高纯氮气
（5） 高速离心机
4. 试剂
本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水
4.1无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质
检查方法：取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。
脱醛方法：取2g*溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1l乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸出的50ml。当乙醇中：
4.2 10%抗坏血酸溶液（vc） w/v 临用前配制
4.3 50%氢氧化钾溶液（koh） w/v
4.4 无水 重蒸，不含过氧化物
4.4.1过氧化物检查方法：用5ml加1ml10%*溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该需处理后使用。
4.4.2 去除过氧化物的方法：重蒸时，瓶中放入铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。
4.5 ph 1-14试纸
4.6 * na2so4
4.7 甲醇 色谱纯或分析纯重蒸后使用
4.8 重蒸水 蒸馏水中加入少量*重蒸后使用
4.9 苯并〔e〕芘标准液 称取苯并〔e〕芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成1ml相当于5μg苯并〔e〕芘的内标溶液。
4.10*标准液 *（纯度85%sigma公司）用脱醛乙醇溶解*标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg*。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。*标准液α-生育酚（纯度95% sigma公司），δ-生育酚（纯度95% sigma公司），δ-生育酚（纯度95%sigma公司）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种*标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种*的准确浓度。5.操作步骤
本实验需避光操作
样品皂化 称取样品于三角瓶中，加30ml无水乙醇，振摇三角瓶，使样品分散均匀。加入5ml10%抗坏血酸和苯并〔e〕芘标准液2ml，混匀。*后加入10ml氢氧化钾边加边振摇。于沸水浴上回流30min使样品皂化*。皂化后立即放入冰水中冷却。
样品萃取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50ml水分2次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100ml无水分两次洗皂化瓶及残渣，液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。然后每次用约100ml水将液洗至中性，约4-5次。
浓缩 将提取液经*（约5g）滤入150ml旋转蒸发瓶内，用约15ml冲洗分液漏斗及*2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收，待瓶中剩下约2ml时，取下蒸发瓶，立即用氮气将吹干。加入2ml乙醇溶液，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上以3000转/min离心5分钟。上清液供色谱分析。
标准曲线的制备将*和*标准品配置成标准溶液（约1mg/ml），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。标准浓度的标定方法取*和*标准液若干微升，分别稀释至10.00ml乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。测定条件如下 标 准比吸光系数e1%cm波 长λ，nm 视黄醇 1835 325α—生育酚 71 294γ—生育酚 92.8 298δ—生育酚 91.2 298
浓度计算：
x1= a/e×1/100×10.00/s×10-3
式中 x1：某维生素浓度，mg/ml；
a：维生素的平均紫外吸光值；
s：加入标准的量，μl；
e：某种维生素1%比吸光系数；
10.00/s×10-3 ：标准液稀释倍数。
本法采用内标两点法进行定量。把一定量的*、*及内标苯并〔e〕芘液混合均匀，选择合适的灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程的70%，作为高浓度点，高浓度的1/2为低浓度点（内标苯并〔e〕芘的浓度值不变），用此二种浓度的混合标准进行色谱分析。根据微处理机装置，按说明用二点内标法进行定量。
液相色谱分析
仪器所需条件
预柱：ods 10μm，4mm×4.5cm。
分析柱：ods 5μm，4.6mm×25cm。
流动相：甲醇：水=98：2。混匀，临用前脱气。
紫外检测器波长：300nm。量程0.02。
进样量：20μl进样定量环。
流速：1.65-1.70ml/min。6.计算
x=c/m×v×100/1000
x：某种维生素的含量，mg/100g；
c：由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/ml；
v：样品浓缩定容体积，ml；
m：样品质量，g；
用微处理机二点内标法进行计算时，按计算公式计算或由微机直
接给出结果。7.注意事项
（1） *极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。
（2） 在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化*。
（3） 提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。
（4） 洗涤时，*初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。
（5） *如有结块，应烘干后使用。
（6） 在旋转蒸发时，溶液不应蒸干，以免被测样品含量有损失。
（7） 用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。您可能会对本公司的以下产品感兴趣：
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（2） 六孔恒温水浴锅
（3） 旋转蒸发器
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4. 试剂
本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水
4.1无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质
检查方法：取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。
脱醛方法：取2g*溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1l乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸出的50ml。当乙醇中：
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4.4 无水 重蒸，不含过氧化物
4.4.1过氧化物检查方法：用5ml加1ml10%*溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该需处理后使用。
4.4.2 去除过氧化物的方法：重蒸时，瓶中放入铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。
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4.8 重蒸水 蒸馏水中加入少量*重蒸后使用
4.9 苯并〔e〕芘标准液 称取苯并〔e〕芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成1ml相当于5μg苯并〔e〕芘的内标溶液。
4.10*标准液 *（纯度85%sigma公司）用脱醛乙醇溶解*标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg*。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。*标准液α-生育酚（纯度95% sigma公司），δ-生育酚（纯度95% sigma公司），δ-生育酚（纯度95%sigma公司）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种*标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种*的准确浓度。5.操作步骤
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样品皂化 称取样品于三角瓶中，加30ml无水乙醇，振摇三角瓶，使样品分散均匀。加入5ml10%抗坏血酸和苯并〔e〕芘标准液2ml，混匀。*后加入10ml氢氧化钾边加边振摇。于沸水浴上回流30min使样品皂化*。皂化后立即放入冰水中冷却。
样品萃取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50ml水分2次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100ml无水分两次洗皂化瓶及残渣，液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。然后每次用约100ml水将液洗至中性，约4-5次。
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式中 x1：某维生素浓度，mg/ml；
a：维生素的平均紫外吸光值；
s：加入标准的量，μl；
e：某种维生素1%比吸光系数；
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分析柱：ods 5μm，4.6mm×25cm。
流动相：甲醇：水=98：2。混匀，临用前脱气。
紫外检测器波长：300nm。量程0.02。
进样量：20μl进样定量环。
流速：1.65-1.70ml/min。6.计算
x=c/m×v×100/1000
x：某种维生素的含量，mg/100g；
c：由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/ml；
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