冰冻切片如何做mIHC？
一、前言：
多重荧光免疫组化(mihc)主要的技术原理来自tsa技术，tsa即酪酰胺信号放大，是一类利用辣根过氧化酶(hrp)对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。用这种方法做多重荧光染色是利用二抗上带有的hrp（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素，该荧光素在hrp和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后进行微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。
因为涉及到多次微波，似乎也只有石蜡切片能经得起这番造作，而手中只有冰冻样本的老师，以往只能望洋兴叹，因为冰冻切片经不起甚至一轮的热处理。但随着技术的发展，这个难题也在逐渐被攻克，为了使得更多老师能够用上mihc这项技术，absin推出了抗体洗脱液(abs994)，现在一起来看看冰冻切片的多色实验该如何开展吧~
二、建议操作步骤：
1、样本准备
1）固定包埋：获取新鲜组织，用4%多聚甲醛低温固定，pbs缓冲液洗三次，每次15min；30%蔗糖沉降脱水，oct包埋；
2）切片：使用冷冻切片机，将组织冰切成3-5μm的切片（对于储存在-80℃下的组织，制备切片前，需转移到-20℃冰箱中平衡约15min），粘贴于防脱载玻片上，室温晾片30-60min。切片放入pbs中浸洗3次，每次5min，去除oct；
3）淬灭内源性过氧化物酶：滴加3% h2o2，室温下孵育10-30min，pbs浸洗5min×3次。
2、多色实验
1）封闭：滴加封闭液，室温孵育30min，除去封闭液；
2）一抗孵育：弃封闭液，滴加稀释好的的一抗工作液，于避光湿盒内4°c孵育过夜或37℃ 1-2h（湿盒中可加少量水，防止抗体孵育过程干片），pbs浸洗5min×3次；
3）二抗孵育：滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织，避光室温孵育20-50min，pbs浸洗5min×3次；
4）染料孵育：滴加现配的1*tsa染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），反应2-15min，pbs浸洗5min×3次；
5）抗体洗脱：滴加适量37℃预热至充分溶解的抗体洗脱液(abs994)覆盖样本，10s后甩去，再次滴加抗体洗脱液没过整个样本并稍微鼓起，37℃湿盒孵育5-20min（根据切片厚度，一抗种类调整洗脱温度和时间，洗脱难度：结构性膜蛋白和细胞骨架蛋白＞胞浆蛋白＞胞核蛋白），pbs浸洗5min×3次；
6）重复进行[1封闭→5抗体]洗脱过程，直到完成所有指标染色；
7）滴加1*dapi工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min，pbs浸洗5min×3次；
8）滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡；
9）扫描成像，数据分析。
三、注意事项：
1、若某些抗体难以洗脱，建议降低一抗稀释比例，或将该靶点排到最后一轮进行染色；
2、抗体洗脱液在使用时要根据实际情况调整孵育时间和洗脱温度，若时间太长有可能损伤抗原靶点以及细胞核形态；
3、请在包埋之前先固定样本，切片后固定可能不耐受多次标记与洗脱；
4、冰冻切片请控制切片厚度不超过5um，太厚的样本可能影响染色效果。
虽然抗体洗脱液解决了冰冻切片无法热修复的问题，但多轮洗脱依旧可能存在脱片的情况，可用白片进行多次抗体洗脱判断片子的耐受情况，来决定最终染色的靶点数量。
货号
产品名称
规格
货期
abs50012
四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔二抗）
20t
现货
abs50028
四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（兔二抗）
20t
现货
abs50013
五色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔二抗）
20t
现货
abs50029
五色多重荧光免疫组化染色试剂盒（兔二抗）
20t
现货
abs50014
六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔二抗）
20t
现货
abs50030
六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（兔二抗）
20t
现货
abs50037
七色多重荧光免疫组化染色试剂盒plus（鼠兔二抗）
20t
现货
abs50038
七色多重荧光免疫组化染色试剂盒plus（兔二抗）
20t
现货
abs994
抗体洗脱液（mihc专用）
30ml
现货
好消息！absin文献奖励重磅升级！
absin特色产品线：
wb相关：ecl发光液、预染marker、预制胶；ihc相关：二抗试剂盒、组化笔；ip/coip试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、bsa、蛋白酶k、ctb、ttx、cee；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；elisa试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
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因为涉及到多次微波，似乎也只有石蜡切片能经得起这番造作，而手中只有冰冻样本的老师，以往只能望洋兴叹，因为冰冻切片经不起甚至一轮的热处理。但随着技术的发展，这个难题也在逐渐被攻克，为了使得更多老师能够用上mihc这项技术，absin推出了抗体洗脱液(abs994)，现在一起来看看冰冻切片的多色实验该如何开展吧~
二、建议操作步骤：
1、样本准备
1）固定包埋：获取新鲜组织，用4%多聚甲醛低温固定，pbs缓冲液洗三次，每次15min；30%蔗糖沉降脱水，oct包埋；
2）切片：使用冷冻切片机，将组织冰切成3-5μm的切片（对于储存在-80℃下的组织，制备切片前，需转移到-20℃冰箱中平衡约15min），粘贴于防脱载玻片上，室温晾片30-60min。切片放入pbs中浸洗3次，每次5min，去除oct；
3）淬灭内源性过氧化物酶：滴加3% h2o2，室温下孵育10-30min，pbs浸洗5min×3次。
2、多色实验
1）封闭：滴加封闭液，室温孵育30min，除去封闭液；
2）一抗孵育：弃封闭液，滴加稀释好的的一抗工作液，于避光湿盒内4°c孵育过夜或37℃ 1-2h（湿盒中可加少量水，防止抗体孵育过程干片），pbs浸洗5min×3次；
3）二抗孵育：滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织，避光室温孵育20-50min，pbs浸洗5min×3次；
4）染料孵育：滴加现配的1*tsa染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），反应2-15min，pbs浸洗5min×3次；
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7）滴加1*dapi工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min，pbs浸洗5min×3次；
8）滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡；
9）扫描成像，数据分析。
三、注意事项：
1、若某些抗体难以洗脱，建议降低一抗稀释比例，或将该靶点排到最后一轮进行染色；
2、抗体洗脱液在使用时要根据实际情况调整孵育时间和洗脱温度，若时间太长有可能损伤抗原靶点以及细胞核形态；
3、请在包埋之前先固定样本，切片后固定可能不耐受多次标记与洗脱；
4、冰冻切片请控制切片厚度不超过5um，太厚的样本可能影响染色效果。
虽然抗体洗脱液解决了冰冻切片无法热修复的问题，但多轮洗脱依旧可能存在脱片的情况，可用白片进行多次抗体洗脱判断片子的耐受情况，来决定最终染色的靶点数量。
货号
产品名称
规格
货期
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四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔二抗）
20t
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20t
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20t
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30ml
现货
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